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| 分析全般について・・・
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| Q. | 依頼するにあたって、どのような手続きが必要ですか？ | |||||||||||||||
| まずはメール、お電話などで直接お問い合わせ下さい。分析目的、サンプル情報を参考に
分析方法についてご相談させていただきます。事前にサンプル量見積もりの参考資料（電気泳動画像等）をご用意
下さい。打ち合わせ終了後、サンプルをお送りいただく際に分析依頼書をＦＡＸ にて送信していただくことで正式
なご依頼とさせていただきます。 大まかな依頼の流れはこちらをご参照下さい。 |
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| Q. | サンプル調製時の注意点はありますか? | |||||||||||||||
| こちらに一般的な注意点をまとめて記載しております。 また、サンプル形態別の注意点も併せて UP しておりますので、ご参照下さい。 |
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| Q. | 分析結果はどの位でもらえますか？ | |||||||||||||||
| 通常サンプルを受け取ってから2週間以内にメールによる結果速報をお送りしております。（ただし、分
析内容や検体数、サンプル受け取りのタイミングによって異なります。）その後正式な報告書を郵送にてお送り
しております。 |
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| Q. | タンパク質を同定する方法について教えてください。 | |||||||||||||||
| タンパク質を同定する方法としては、大きく分けてプロテインシークエンサーを使用した方法と質量分析による方法の2種類があります。
質量分析による方法は基本的にデータベースサーチに依存しておりますので、目的の配列がデータベースに登録されている必要があります。
プロテインシークエンサーによる方法は確実な配列決定が可能ですが、pmol オーダーのサンプル量が必要となります。
サンプルの由来となる生物種やご用意可能なサンプル量によってご提案できる分析方法が異なりますので、まずはお問合せ下さい。 |
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| Edman法によるアミノ酸配列分析について・・・
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| Q. | Ｎ末端アミノ酸配列分析の場合、サンプルはどういう形態のものが分析できますか？ | |||||||||||||||
| 電気泳動後 PVDF 膜に転写した膜サンプル、溶液、凍結乾燥品などから分析可能です。ただし、
溶液、凍結乾燥品はかなり精製度の高いサンプルである必要があります。また、溶液の組成（凍結乾燥前の溶液組成）
によっては分析が難しい場合がありますので、事前に溶液組成についてご連絡下さい。なお、電気泳動後のゲル片を
直接分析することは出来ませんのでご注意下さい。 |
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| Q. | 目的サンプルがＮ末端ブロックだった時、次にどのような分析が考えられますか？ | |||||||||||||||
| まず内部配列分析が考えられます。内部配列分析は、ゲル内消化、断片ペプチドの逆相
HPLC による分離、分離されたペプチドピークをプロテインシークエンサーにて分析して配列決定する方法です。
内部の配列を決定しますので、N末端ブロックのサンプルでも配列決定が可能です。また、生物種によっては MA
LDI-TOF MS による PMF、LC-MS/MS も有効な手段といえます。 |
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| Q. | 分析結果が得られなかった場合の料金はどうなりますか？ | |||||||||||||||
| ＜Ｎ末端アミノ酸配列分析＞ Ｎ末端アミノ酸がブロックされていた場合、検出感度以下のサンプル量であった場合、複数のタンパク質（ペプチド） が混在していた場合※1 には、配列決定には至らず解析不能となります。 通常感度解析不能料金： \40,000 （消費税別） 高感度解析不能料金 ： \60,000 （消費税別） ＜内部配列分析＞ 検出感度以下のサンプル量であった場合、複数のタンパク質（ペプチド）が混在していた場合※1には、配列決定には至らず解析不能となります。 通常感度・高感度解析不能料金： \100,000 （消費税別） ※1：複数のタンパク質（ペプチド）が混在していても、収量差がはっきりしていれば配列を決定できる場合もあります。 |
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| Q. | 手持ちのサンプルを分析する際、高感度分析と通常感度分析のどちらが適当か、どう判断すればいいでしょうか？ | |||||||||||||||
| サンプル量見積もりの参考となるような資料（サンプルを電気泳動された画像や最終精製時のクロマトグラム）
をメールまたはＦＡＸにてお送り下さい。資料を参考に、弊社で大まかにサンプル量を見積もり、折り返しコメント
（通常感度分析可能か、あと何倍量程度から分析が望ましいか等）させていただきます。 |
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| Q. | Ｎ末端配列分析や内部配列分析はどれくらいのサンプル量があれば分析できますか？ | |||||||||||||||
| N末端アミノ酸配列分析、内部配列分析ともにサンプル量に応じて通常感度分析と高感度分
析を設定しています。 N末分析：通常感度 2pmol以上、高感度 0.2pmol以上 内部配列分析：通常感度 10pmol以上、高感度 1-10pmol ただし、上記サンプル量は同定目的の分析を基準に設定しております（N末分析の場合は8 - 10残基程度、内部配 列分析は1ペプチドピークについて8 - 10残基程度）。長い配列決定や内部で複数ペプチドについて分析する必要 がある場合は、より十分なサンプル量が必要となります。 |
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| Q. | できる限り配列を読みたいのですが、シークエンサーではだいたい何残基くらいまで読めますか？ | |||||||||||||||
| 標準タンパク質の例としては、5pmol, HSA を５０残基程度決定したこともございます。受託サンプル
について数十〜百 pmol 程度のサンプル量で５０残基以上決定したこともございます。ただし、何残基決定できるかは、サンプル量だけでなく、配列や調製方法等にも依存いたしますので、一概には申し上げられないところです。また、配列中にS-S
結合が存在する場合、そのサイクルから反応が急に低下することがあります。そのため、より長い配列を読むためには、十分なサンプル量で、かつ還元アルキル化処理したサンプルをご用意いただくことをお勧めいたします。 |
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| Q. | PVDF膜はどこのメーカーのものでも使えますか？ | |||||||||||||||
| シークエンスグレードの膜であれば特に指定のメーカーはございません。ただし、GE
ヘルスケアバイオサイエンス（株）（旧アマシャムバイオサイエンス社）の Hybond-P
はプロテインシークエンサーに使用できないことが分かっておりますのでご注意下さい。 |
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| Q. | Ｃ末端配列分析も可能ですか？ | |||||||||||||||
| Ｃ末端のアミノ酸配列を直接決定するという分析は、残念ながら実施しておりません。 一般にＣ末端から直接シークエンサーにて分析するという方法も nmol オーダーのサンプルを必要とし、長い配列を決定することは困難という点もあることから、今のところＣ末端配列分析を簡便に行う決定的な分析方法はないようです。 ただし、分析に必要な条件が揃えば、質量分析にてＣ末端の配列を決定出来る場合もございます（→受託分析Ｑ&Ａの質量分析の項参照）。 |
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| Q. | デブロッキング処理してからＮ末端配列を決定することは可能ですか？ | |||||||||||||||
| 全てのＮ末端修飾について効果的なデブロッキングの方法は残念ながら未だ確立されておりません。 弊社でもデブロッキングの方法については検討しております。N末端がアセチルセリン、アセチルスレオニン、もしくはピログルタ ミン酸に対しては有効な方法を確立しております。ただし、既知配列であることが前提となっており、基本的には配列の確認が目的 となります。また、分析には 50pmol 以上のサンプル量が必要となります。 |
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| Q. | SDS が入ったサンプルも分析できますか? | |||||||||||||||
| 濃度によっては分析可能です。サンプルの溶液組成、サンプル量見積もりの参考資料（サンプルの電気泳動
画像等）についてご連絡下さい。 |
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| 質量分析について・・・
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| Q. | 自分が持っている配列データを使ってデータベース検索をしてもらえますか？ | |||||||||||||||
| 可能です。ご提供いただいた配列データを元にプライベートデータベースを作成し、それに対してサーチいたします。 |
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| Q. | サンプルはどういう形態のものが分析できますか? | |||||||||||||||
| タンパク同定を目的とした LC-MS/MS や MALDI-TOF MS による PMF 分析の場合、基本的には電気
泳動後のゲル片からの分析となりますが、PVDF 膜サンプルや溶液サンプルからでも分析は可能です。 ただし、溶液サンプルの場合、溶液組成によっては分析が困難な場合もありますのであらかじめ溶液組成についてご連絡く ださい。精密質量測定の場合は溶液サンプルからの分析となります。この場合も溶液組成について事前にご相談させていた だく必要がございます。 |
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| Q. | 銀染色のサンプルでも分析可能でしょうか？また、推奨する染色方法があれば教えて下さい。 | |||||||||||||||
| 質量分析用の銀染色（グルタルアルデヒドを含まない）であれば問題なく分析可能です。各メーカーより
キットとしても販売されております。推奨するキットについては別途お問合せ下さい。 その他、SYPRO Ruby 染色、 CBB 染色でも分析可能です。 |
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| Q. | 手持ちのサンプルで分析可能か、どう判断すればいいでしょうか？ | |||||||||||||||
| サンプルを電気泳動された画像がございましたらメールにてご連絡下さい。画像のみから正確にはサンプル量を
見積もることはできませんが、弊社で大まかにサンプル量見を積もり、分析の可能性等について折り返しコメントさせていただきます。 |
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| Q. | 質量分析の結果から定量的な考察はできるのでしょか？ | |||||||||||||||
| イオン化の効率はサンプル量だけでなく、配列や修飾の有無によって大きく異なります。そのため、
質量分析の結果（イオン強度）から定量的な考察をすることは出来ません。 |
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| Q. | 修飾部位解析の成功率はどのくらいですか？ | |||||||||||||||
| 修飾部位解析はサンプルに大きく依存いたしますので、同定率を一概には言うことは出来ません。
サンプル量だけでなく、配列、修飾率が大変重要となりますので、サンプルは出来るだけ多い量を、また、例えば
in vitro で修飾されている場合は反応が十分進んだサンプルをご用意いただければと思います。最も分析例の多いリン酸化部位解析の
場合、弊社で修飾部位を決定出来たサンプルの多くは CBB にて検出可能な量からの分析でした。 |
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| Q. | PMF と LC-MS/MS それぞれの同定方法メリット・デメリットを教えて下さい。 | |||||||||||||||
| 両分析の最も大きな違いは MS/MS データ（配列由来のデータ）までとれるかどうかという点です。 PMF 分析はプロテアーゼ処理後の断片ペプチドの質量の組み合わせデータのみをデータベースサーチするのに対し、LC-MS/MSは 断片ペプチドの質量データと MS/MS のデータ（配列由来のデータ）を使ってデータベースサーチいたしますので、このタンパクの この配列と一致したというデータが得られます。 両者の分析の違いについて、簡単にまとめた表がございますのでご参照下さい。 http://www.aprosci.com/jutaku/difference.htm#difference |
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| Q. | Ｃ末端配列の分析も出来ますか？ | |||||||||||||||
| C末端部位の解析は質量分析にて実施いたしますが、既知配列であること、C末端部位が予想されるサンプル
であることが前提となります。分析手順としては、 １．ESI-MS による PMF 分析：予想されるC末端部位情報に基づいて選択したプロテアーゼを使用してサンプルをペプチド断片 化し、断片化ペプチドの質量を ESI-MS にて測定します。これにより、予想されるＣ末端部位を含むペプチドが検出されていることを確認します。 ２．nano ESI-MS/MS 分析：１．で検出されたＣ末端ペプチドの MS/MS データが得られれば、配列まで確認することが可能です。 なお、予想されるC末端部位の情報がない場合、事前にMALDI-TOF MS による精密質量測定を実施し、配列情報と照合することにより Ｃ末端部位を絞り込むことも可能です。ただし、精密質量測定によりC末端部位の絞り込みをする場合、精製された溶液サンプルであること、 Ｎ末端が既知であること、糖鎖などの修飾等受けてないサンプルであることが前提となります。 |
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| Q. | 分析結果が得られなかった場合の料金はどうなりますか？ | |||||||||||||||
| ＜LC-MS/MS＞ 検出感度以下のサンプル量であった場合には有意の MS/MS シグナルは検出されず、解析不能となります。 LC-MS/MS 解析不能料金： \100,000 （消費税別） 再調製された同一サンプルについて再分析を実施する場合は、 LC-MS/MS基本料金 （\350,000） ※2 − 解析不能料金 （\100,000） ＝ \250,000 （消費税別） にて実施いたします。 ※2：2回の分析で1回分のご請求となります。なお、多検体の場合には別途お問合せ下さい。 サンプル由来のシグナルが検出されているにもかかわらず同定に至らなかった場合（データベース未登録と考えられる場合） は正規基本料金となります。なお、オプションで、MS/MS データからアミノ酸配列を決定・推定する de novo sequencing も可能です。 何らかのタンパク（ケラチンを含む）が同定できた場合も正規基本料金となりますのであらかじめご了承下さい。 ＜MALDI-TOF MSによるPMF＞ 検出感度以下のサンプル量で合った場合には十分なペプチドシグナルが検出されず、データベースからの候補タンパク質の絞込みに至らないことがあります。PMF では、目的のタンパク質の分子量・配列によってはこのようなグレイゾーンがあるため明確に解析不能を定義することができません。従いまして、 同定に至らずとも、シグナルが検出された場合は正規基本料金となります。 再調製された同一サンプルからの再分析については、特価で対応させていただきますので別途お問合せ下さい。 |
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| 電気泳動について・・・
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| Q. | 二次元電気泳動比較解析とはどのようなサービスですか？ | |||||||||||||||
| ラージゲルを使用した二次元電気泳動を行い、泳動後のゲルを SYPRO Ruby で染色し、2サンプル間の二次元電気泳動パターンの比較解析を実施いたします。 なお、スクリーニング的な解析を目的とした場合には、比較解析の基本である n=1から実施いたしますが、統計的な評価が必要な場合には n=3以上での実施をご検討下さい（価格については別途お問い合わせください）。 | ||||||||||||||||
| Q. | 二次元電気泳動で各サンプルとも複数枚泳動し、個体差の少ないスポットについて比較解析をしたいのですが可能ですか？ また、料金は基本料金からどのくらい変わりますか？ |
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| 比較解析に使用するソフト Progenesis PG 220 ( PerkinElmer社 )は、同一群内のゲルデータを平均化したアベレージゲルを作製した後、群間の比較解析をこのアベレージゲルに基づいて実施いたします。 基本料金はラージゲルによる泳動（ゲル2枚）、比較解析（1セット）を含んでおりますが、泳動するゲルの枚数、比較解析のセット数によって料金が異なりますので、別途お問い合わせ下さい。 | ||||||||||||||||
| Q. | 二次元電気泳動はどのようなサンプル形態のものから受け付けてもらえますか？組織からでも対応してくれますか？ | |||||||||||||||
| 二次元電気泳動用の可溶化バッファーにて調製されたもの、培養組織などが基本となります。組織からも実施いたしますが、前処理に別途料金が必要となる場合がございますので、まずはお問合せ下さい。 | ||||||||||||||||
| Q. | 二次元電気泳動はどのような条件で行いますか？ | |||||||||||||||
| 以下の条件にて二次元電気泳動を実施します。 ミニゲル（7cm）、ラージゲル（17cm）の2種類のサイズがあります。
適用タンパク質量などはお打ち合わせの上、分析を行います。 |
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| Q. | 培養細胞からサンプルを調製しているのですが、注意点はありますか？ | |||||||||||||||
| 培養細胞からのwhole cell lysate調製においては、次の点をご注意下さい。 ・ 接着性培養細胞の回収に際して、トリプシンは使用しないのが望ましい。 ・ 血清入りの培地をご使用の場合には、PBS などにて細胞の洗浄を十分に実施して下さい。 ・ イオン性の界面活性剤を含む溶液サンプル、塩濃度の高い溶液サンプルの場合には、泳動パタ ーンが乱れる可能性があります。 ・ 培養細胞必要量は1×106 個以上を目安として下さい。 【過去の分析におけるタンパク質回収例】 ・ 培養細胞 2×106 個 → 可溶化バッファー 200μl → 1mg/ml（200μg protein） ・ 組織 50mg wet weight → 可溶化バッファー 500μl → 2〜10mg/ml（1〜5mg protein） その他、詳しくはお電話にてご相談させていただきます。 | ||||||||||||||||
| Q. | 比較解析はどのように行っていますか？ | |||||||||||||||
| SYPRO Ruby で染色後のゲルから蛍光イメージャーを使用して泳動画像を取り込み、画像解析ソフトProgenesis PGシリーズ(PerkinElmer社) にてディファレンシャル解析を行います。解析ソフトに関してはPerkinElmer社のホームページをご覧下さい。 | ||||||||||||||||
| Q. | どのような報告書を頂けるのでしょうか？ | |||||||||||||||
| SYPRO Ruby染色画像、発現量に差のあるスポットに印を付けた画像、また発現量に差があるスポットの数値データを添付します。 その後、興味のあるスポットについて引き続きタンパク質同定を行うことが可能です（別途費用が必要となります）。 | ||||||||||||||||
| Q. | タンパク質同定するスポットはどのように選びますか？ | |||||||||||||||
| 画像解析ソフトにより、差異のあるスポットとして抽出されたものの中から、タンパク質同定を実施するスポットを選んでいただきます（タンパク質同定には別途費用が必要となります）。 | ||||||||||||||||
| Q. | 分析をお願いすると何日間で報告を頂けますか？ | |||||||||||||||
| 基本分析（2サンプルの比較解析）での納期は比較解析の速報を3週間で、 e-mail
にてご連絡いたします。 3サンプル以上の泳動をご依頼の場合や、お急ぎの場合は別途お問い合わせ下さい。 | ||||||||||||||||
| Q. | リン酸化タンパク質の検出をお願いしたいのですが可能でしょうか？ | |||||||||||||||
| 可能です（別途染色液代がかかります）。使用染色液は ProQ-Diamond （Invitrogen）ですが、その他指定の試薬等ございましたら、別途ご連絡下さい。 | ||||||||||||||||
| Q. | 泳動後のゲルは返却してもらえるのでしょうか？ | |||||||||||||||
| 弊社までお引取りに来ていただける場合はお渡しできますが、基本的には宅急便等での返送はできません（コンタミネーションやゲルの破損等の可能性がある為）。 | ||||||||||||||||
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